STED

原理

STED 显微镜使用第二条红移光束。所有被 STED 光照射的分子都被限制在基态（关闭态）。其关键是更改 STED 光束，使光束中心有一个光强为零的小孔，例如我们都知道的 STED “甜甜圈” 形状。这样，除甜甜圈中心以外的所有分子都暂时性保持暗态。所有检测到的荧光一定是来自这个亚衍射区域 – 所以现在可更精确地确定其位置。由此突破了衍射极限。

以下为荧光分子 STED 过程的雅布朗斯基能级图。光学激发 (1) 从基态 S0到第一激发态 S1 后， 可通过两种方式回到基态：如果分子位于含有 STED 光子的区域，电子受激回迁到基态，无荧光出现 (2)。如果分子位于甜甜圈光束中心，电子将在发射荧光光子的情况下返回基态 (3)。

设置

要实施 STED 技术，显微镜设计应考虑除激发光束外的第二条聚焦光束 (STED 光）。高于饱和阈值的 STED 光迫使其照射区域内的分子进入关闭状态。相位板负责将普通 STED 光束转变为甜甜圈形。

两条光束会聚重叠在一起，扫描样品，得到完整的图像。在每个位置，只有来自焦点正中心的信号被探测。

结果

STED 显微镜是突破光学显微镜衍射极限的技术。STED 理论上可实现无限高分辨率，可由“修正”的阿贝公式表示：

其中 Δx 表示可分辨的最小特征，λ 表示激发波长，I 表示 STED 光强。NA 是物镜的数值孔径，I_sat 表示染料对 STED 光子反应的程度。

严格来说，探测器只需探测到一个光子就可以纳米级分辨率识别单个分子（或分子簇）。无需任何数学算法去渲染生成超过分辨率极限的图像，STED 是纯物理学法则！ 分子被区分后，可更好地定位（见下图）。