STED

受激发射损耗

原理

STED 显微镜使用第二条红移光束。所有被 STED 光照射的分子都被限制在基态(关闭态)。其关键是更改 STED 光束,使光束中心有一个光强为零的小孔,例如我们都知道的 STED “甜甜圈” 形状。这样,除甜甜圈中心以外的所有分子都暂时性保持暗态。所有检测到的荧光一定是来自这个亚衍射区域 – 所以现在可更精确地确定其位置。由此突破了衍射极限。

以下为荧光分子 STED 过程的雅布朗斯基能级图。光学激发 (1) 从基态 S0到第一激发态 S1 后, 可通过两种方式回到基态:如果分子位于含有 STED 光子的区域,电子受激回迁到基态,无荧光出现 (2)。如果分子位于甜甜圈光束中心,电子将在发射荧光光子的情况下返回基态 (3)。

设置

要实施 STED 技术,显微镜设计应考虑除激发光束外的第二条聚焦光束 (STED 光)。高于饱和阈值的 STED 光迫使其照射区域内的分子进入关闭状态。相位板负责将普通 STED 光束转变为甜甜圈形。

两条光束会聚重叠在一起,扫描样品,得到完整的图像。在每个位置,只有来自焦点正中心的信号被探测。

结果

STED 显微镜是突破光学显微镜衍射极限的技术。STED 理论上可实现无限高分辨率,可由“修正”的阿贝公式表示:

其中 Δx 表示可分辨的最小特征,λ 表示激发波长,I 表示 STED 光强。NA 是物镜的数值孔径,I_sat 表示染料对 STED 光子反应的程度。

严格来说,探测器只需探测到一个光子就可以纳米级分辨率识别单个分子(或分子簇)。无需任何数学算法去渲染生成超过分辨率极限的图像,STED 是纯物理学法则! 分子被区分后,可更好地定位(见下图)。