自适应照明

自适应照明？

它是什么

FAQ 11

“自适应照明的工作原理是什么？”

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我们的自适应照明包括三种相关但又不同的技术：RESCUE、DYMIN 和 MINFIELD。这三种技术的共同点是，对于扫描过程中的每个像素来说，可根据样品内的结构，动态调整激光光照剂量，而不是像通常的所有位置无差别使用相同激光功率。图像暗区和失焦区几乎不会有照射，而有荧光标记并在焦平面的区域则以 100% 的信号和分辨率成像。这意味着激光只集中于效果最大的区域，而不照射其他区域。

自适应照明可显著减少光漂白，并可长时间进行三维体量成像或连续采集数十帧图像，而常规 STED 早就漂白了样品。自适应照明是减少您宝贵样品光照剂量的首选！

共聚焦探测

RESCUE

对于扫描过程中的每一个像素来说，RESCUE （缩短状态转换周期）可快速探测是否存在结构，如果不存在，光照将立即关闭。这种快速探测一般在共聚焦模式下进行，时间约为像素总驻留时间的 10% （“共聚焦探测”）。只有在探测阶段发现信号，光照和探测才会在剩余像素驻留时间里继续进行。

在典型样品中，假定 80% 为暗区，RESCUE 可将样品接受的 STED 光子数量减少 80%，接受的激发光子数量减少 70%，而不影响分辨率或信号等等。进一步与DYMIN 结合，并使用我们的脉冲而不是连续波激光，可显著减少光剂量到只有百分之几。这对活细胞或三维体量成像确实非常重要！

在记录体量，譬如一组堆叠的 2D 图像时效果将更为出众，因为 STED 甜甜圈形光束（受衍射限制）在 z 轴方向的尺寸明显大于单个图像的厚度。因此，记录一个图像意味着 STED 光束可毫无意义地照射到其他 20 层图像！ 正因为如此， RESCUE 可实现的效果对于体量成像可放大 20 倍。

使用 DYMIN 实现

更佳探测

在 RESCUE 后，DYMIN (Dynamic Minimum) 将进一步减小用最大 STED 功率照射的样品区域。它在探测时不只是使用激发激光，并且使用少量 STED 激光，分多步实现。对于 RESCUE，当第一步未检测到结构时，光照将关闭。但如果存在结构，接下来将施加少量的 STED 功率以提高分辨率，从而提高探测灵敏度。其关键是较小的 STED 功率已经能快速显著的提高分辨率，这意味着通过微量附加照射，就可获得很多关于荧光结构精确位置的信息。只有在连续提高 STED 功率以确认当前扫描具有样品结构时，才采用全分辨率扫描功率，否则剩余的像素驻留时间内，将立即关闭光照。

进行多步探测不断提高分辨率能减少总体光漂白几个数量级。所取得的收益可以被利用到大幅提高信号强度或增加光学分辨率上。

EASY3D 和 DYMIN 对比常规 STED 显微镜拍摄的哺乳动物细胞核 3D 堆栈图。图中显示xz切面和堆栈采集后的共聚焦图像，可见 DYMIN 显著地减少漂白。请注意，DYMIN 使我们能够以优越的分辨率和信号拍摄完整个堆栈。图中显示的是Vero细胞中用抗体标记的核孔复合物蛋白 (nup153)。

MINFIELD

无 STED 光子的 STED

MINFIELD 是另一种只在需要时才将光束投于样品的照明方式。MINFIELD 避免 STED 甜甜圈形光束对整个视野进行扫描，而是只使用低功率的 STED 甜甜圈中央孔洞来扫描荧光结构。很明显，此时成像区域必须小于甜甜圈中心的衍射极限孔，但却会获得STED 领域里无与伦比的分辨率。

3D MINFIELD 显示竖直的 DNA 纳米尺，间隔为 91 nm，xz 视图。共聚焦和 MINFIELD 图像，视野大小 180 nm x 300 nm。